全血RNA提取

原理

紅細(xì)胞裂解液選擇性裂解紅細(xì)胞,然后du特的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解白細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

材料與儀器

鮮血液
抗凝劑 紅細(xì)胞裂解液RLB 去蛋白液RW1 乙醇 漂洗液RW
制冰機(jī) 離心機(jī) 離心管 移液槍 移液管 針頭 注射器 水浴鍋

步驟

一、在適合大小的RNase free離心管中加入1體積（<1.5 ml）加入各種抗凝劑新鮮血液 (顛倒混勻后)和3體積的紅細(xì)胞裂解液RLB，顛倒混勻，可輕彈管壁，確保混勻。

二、室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細(xì)胞）。

如果RNA降解嚴(yán)重，可在冰上裂解，但是時(shí)間可長(zhǎng)一些以充分裂解。

三、12 000 rpm離心20秒，倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)。

離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說明紅細(xì)胞裂解很不充分，應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟二、三。

上清盡可能的吸棄，殘留過多會(huì)稀釋裂解液，造成裂解結(jié)合異常，產(chǎn)量純度降低。

四、渦旋或者輕彈管壁將白細(xì)胞沉淀wan全松散重懸，加入350 ul（<0.5 ml全血）或者600 ul（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。病人血樣中白細(xì)胞數(shù)量可能大幅增加，應(yīng)該適當(dāng)減少處理量。或者按照350 ul（<2x106白細(xì)胞）或者600 ul（2x106-1x107白細(xì)胞）比例加RTL。

五、用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9 mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

六、較精確估計(jì)裂解物體積，加入等體積的70%乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

七、立刻將混合物(每次小于700 ul，多可以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm離心60秒，棄掉廢液。

八、加700 ul 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12 000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

如果DNA殘留明顯，可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心。

九、加入500 ul漂洗液RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12 000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500 ul漂洗液RW，重復(fù)一遍。

十、將吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

十一、取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50 ul RNase freewater（事先在 70-80℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12 000 rpm 離心1分鐘。

十二、如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白細(xì)胞，加30-50 ul RNase free water重復(fù)步驟十一，合并兩次洗脫液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高，分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15-30%，但是濃度要低，用戶根據(jù)需要選擇。

注意事項(xiàng)

1. 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入zhi定量無(wú)水乙醇。

2. 使用前將10X紅細(xì)胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。

3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT 4℃可放置一個(gè)月。

常見問題

1. 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入zhi定量無(wú)水乙醇。

2. 使用前將10X紅細(xì)胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。

3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLT 4℃可放置一個(gè)月。

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