細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法

我們知道環(huán)境中廣泛存在的格蘭氏陰性菌容易污染生產(chǎn)過程，其裂解后會釋放出內(nèi)毒素，因內(nèi)毒素耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)而難以滅活，所以一旦有內(nèi)毒素污染進(jìn)入血液，即使極少量也能引起發(fā)熱休克等嚴(yán)重反應(yīng)，因而內(nèi)毒素與其他已知熱原污染物相比，顯示更強(qiáng)的熱原性。

而熱原檢測不同于無菌檢測，兩者應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。無菌檢測通常檢測微生物產(chǎn)生的活生物體或孢子，但無法檢測內(nèi)毒素，只能進(jìn)行熱原檢測。下面我們來簡單了解有哪些檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的不同方法有家兔熱原檢查法、凝膠法(鱟試劑)、光度測定法(鱟試劑)、重組C因子法等

一、家兔熱原檢查法

20世紀(jì)40年代，第12版美國藥典中納入了第一個(gè)基于兔子模型的熱原實(shí)驗(yàn)。兔子熱原測試是將樣本注射到多只兔子體內(nèi)，致熱物質(zhì)的存在導(dǎo)致兔子在注射3-6 h后發(fā)熱。兔子熱原試驗(yàn)(RPT)的基礎(chǔ)是測量兔子在靜脈內(nèi)注射待測樣品的無菌溶液后溫度的升高。如果樣品中含有熱原，兔子的體溫會升高0.6℃。

優(yōu)點(diǎn): 可以檢測所有類型的熱原物質(zhì)；

缺點(diǎn): 動(dòng)物個(gè)體差異大導(dǎo)致檢測靈敏度低；對于毒性大的藥物如放射性藥物或腫瘤抑制劑等，無法進(jìn)行檢測；定性而非定量方法，不能用于藥品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。

二、 鱟試劑檢查法

20世紀(jì)70年代，分為凝膠法、濁度法和顯色基質(zhì)法。這是一種使用鱟變形細(xì)胞裂解物測定內(nèi)毒素的體外方法。主要試劑鱟變形細(xì)胞裂解物(LAL)是從鱟(Limulus polyphemus)中提取的血細(xì)胞(變形細(xì)胞)的水提取物。鱟試劑法的反應(yīng)機(jī)理是細(xì)菌內(nèi)毒素在二價(jià)陽離子參與下激活鱟血細(xì)胞溶解物中的一系列凝聚酶的反應(yīng)。

優(yōu)點(diǎn): 易操作，靈敏度高，可用于內(nèi)毒素定量檢測；

缺點(diǎn): 鱟血批次間有差異；對革蘭氏陰性菌以外的內(nèi)毒素不靈敏；易受β-葡聚糖(β-Glucans)影響而產(chǎn)生假陽性；鱟受到動(dòng)物保護(hù)，無法大批量供應(yīng)。

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三、 重組C因子法

21世紀(jì)初，通過重組方法產(chǎn)生C因子。因子C是由內(nèi)毒素結(jié)合激活的級聯(lián)反應(yīng)的第一個(gè)成分，C因子激活B因子。另一種替代途徑是G因子被葡聚糖結(jié)合激活。C因子和G因子都將促凝血酶轉(zhuǎn)變?yōu)槟浮?/span>C因子可以選擇性地識別內(nèi)毒素并觸發(fā)蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)。因子C已被純化和克隆以創(chuàng)建內(nèi)毒素特異性測定。

優(yōu)點(diǎn): C因子來源穩(wěn)定，受批次影響小；操作簡單快速；更強(qiáng)的抗干擾能力(不受β-glucans影響)；專屬性好。

缺點(diǎn): 來源于不同品種鱟血蛋白序列的重組蛋白對內(nèi)毒素的反應(yīng)性可能不同。

rFC檢測的原理是內(nèi)毒素結(jié)合會激活重組C因子。這種活性結(jié)合會裂解合成底物，從而產(chǎn)生熒光化合物，該測定在96孔板上進(jìn)行。使用380/440nm的激發(fā)波長，在零時(shí)和37℃±1℃下孵育一小時(shí)后，在微孔板讀數(shù)中測量熒光。對數(shù)凈熒光(1 h和時(shí)間零讀數(shù)之間的差異=ΔRFU)與對數(shù)內(nèi)毒素濃度成正比，并且在0.005-5.0EU/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

四、 單核細(xì)胞活化試驗(yàn)

單核細(xì)胞激活試驗(yàn)(MAT)有助于檢測和量化激活人類單核細(xì)胞以釋放負(fù)責(zé)發(fā)燒反應(yīng)的介質(zhì)的物質(zhì)。該測試探索人類發(fā)燒反應(yīng)，提供比RPT更好的熱源活動(dòng)信息。該測試不僅可以確定內(nèi)毒素?zé)嵩€可以幫助確定非內(nèi)毒素?zé)嵩?/span>

MAT測試可檢測細(xì)胞因子、前列腺素(IL-1/IL-3)和由單核細(xì)胞激活的致熱物質(zhì)產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α(TNF-α)。然后使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測這些白細(xì)胞介素。

MAT的一般原理為熱原+人類白細(xì)胞→白細(xì)胞介素 →使用ELISA檢測并以IU/ml進(jìn)行定量。MAT的一般程序包括三個(gè)基本步驟: 激活單核細(xì)胞，孵育產(chǎn)生IL-6，并使用軟件進(jìn)行定量分析。

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