ROS的檢測(cè)方法

ROS在細(xì)胞生命，應(yīng)激和死亡中具介導(dǎo)作用，今天讓我們來(lái)聊下ROS吧~

一、ROS簡(jiǎn)介

活性氧（reactive oxygen species，ROS）廣泛指代氧來(lái)源的自由基和非自由基，包含了超氧陰離子（O2-）、*（H2O2）、羥自由基（OH-）、臭氧（O3）和單線態(tài)氧（1O2），由于它們含有不成對(duì)的電子，因而具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性。

在機(jī)體內(nèi)，ROS的主要來(lái)源之一是線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈底物端，在線粒體中的電子傳遞鏈復(fù)合物將電子傳遞給O2的過程中，有一部分O2被還原，形成O2-或H2O2。其中，最為重要的是O2-，它是大部分的ROS的前體，主要由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的蛋白酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ產(chǎn)生。這部分作為代謝副產(chǎn)物的ROS長(zhǎng)期被當(dāng)作損傷生物大分子的毒性分子，但近年來(lái)被認(rèn)為在較低水平時(shí)作為一類信號(hào)小分子具有生理作用，另一個(gè)ROS的重要來(lái)源是NADPH化酶，其催化亞基被稱為NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能夠在細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)。在不同的組織中已經(jīng)鑒定了6種NOX-2的同瀝物：NOX1，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2，統(tǒng)稱為NOX家族蛋白。這些酶能通過質(zhì)傳遞電子產(chǎn)生ROS，可以大量存在于吞噬細(xì)胞，也在其他各種組織細(xì)胞中以較低水平普遍存在，參與很多膜受體下游信號(hào)激活。

ROS保護(hù)細(xì)胞免受病原體的侵害，但較高濃度的ROS會(huì)誘發(fā)許多疾病，例如惡性腫瘤，糖尿病，關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈粥樣硬化，心臟病并增強(qiáng)衰老過程。

二、檢測(cè)方法

目前有多種方法用于檢測(cè)ROS，包括熒光染色法、電子順磁共振技術(shù)（EPR）、化學(xué)發(fā)光法、色譜法、分光光度法、電化學(xué)生物傳感器以及基于熒光蛋白等七種。在這里，我們將著重介紹熒光染色法，以及其在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS時(shí)的原理和操作步驟。

檢測(cè)原理

目前，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROSzuiguang泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針，其本身不具有熒光，但可以自由穿過細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞，它會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無(wú)法穿過細(xì)胞膜，因此熒光探針會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無(wú)熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備，在最大激發(fā)波長(zhǎng)480nm和最大發(fā)射波長(zhǎng)525nm下檢測(cè)熒光信號(hào)。

檢測(cè)步驟：

1.裝載探針

1）先用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性對(duì)照（Rosup,100mM）到常用工作濃度100μM，對(duì)于刺激時(shí)間較短的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照（Rosup）或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。

2）對(duì)于刺激時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照（Rosup）或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

1.1原位裝載探針（本方法僅適用于貼壁細(xì)胞）

1）細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測(cè)前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到50~70%。

2）誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)誘導(dǎo)物本身特性，以及細(xì)胞類型來(lái)決定。

3）探針裝載：按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μM。吸去誘導(dǎo)用藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液，以覆蓋住細(xì)胞為宜。

4）細(xì)胞清洗：用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1~2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2收集細(xì)胞后裝載探針（適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

1）細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測(cè)所用細(xì)胞狀態(tài)健康。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

2）誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)誘導(dǎo)物本身特性，以及細(xì)胞類型來(lái)決定。

3）探針裝載：離心去除上清，收集細(xì)胞，加入濃度為10μM的DCFH-DA探針，以覆蓋住細(xì)胞為宜。

4）細(xì)胞清洗：用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1~2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
2.檢測(cè)

1）原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2）收集細(xì)胞后裝載探針：用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。