常見的轉(zhuǎn)染方法的原理、特點及步驟

隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，細胞轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究真核細胞基因功能的常規(guī)工具。常用于研究基因功能、基因表達調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學試驗中，其應(yīng)用非常廣泛。那么你知道常見的轉(zhuǎn)染方法的原理、特點及步驟嗎？讓我們一起來看看吧！

一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前實驗室zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。

特點：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的優(yōu)點是能夠高效轉(zhuǎn)染許多細胞系，適用于高通量篩選，并能夠遞送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外，該方法既可應(yīng)用于穩(wěn)定表達，也可應(yīng)用于瞬時表達，與其他化學方法不同的是，其可用于將 DNA 和 RNA 向動物和人體內(nèi)轉(zhuǎn)移；缺點是轉(zhuǎn)染效率依賴于細胞類型和培養(yǎng)條件，因此，需要對每種細胞類型的轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染試劑進行優(yōu)化。

實驗步驟：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復(fù)合物粘附到細胞膜上→復(fù)合物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

二、電穿孔法

利用電脈沖可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的膜上小孔，同時細胞膜上電勢升高，驅(qū)使帶電荷的分子（如 DNA）以類似于電泳的方式經(jīng)臨時微孔穿過細胞膜進入胞內(nèi)（見下圖）。當遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。為確保轉(zhuǎn)染成功，針對實驗條件優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)是極為重要的。電場強度、脈沖形狀、脈沖施加次數(shù)、緩沖液組分等因素都會影響轉(zhuǎn)染效率。

特點：與其他轉(zhuǎn)染方法相比，電轉(zhuǎn)染具有諸多優(yōu)勢，其中主要優(yōu)勢包括：適用于所有細胞類型的瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；在確定最佳電轉(zhuǎn)染條件的情況下，能夠在短時間內(nèi)轉(zhuǎn)染大量細胞。電轉(zhuǎn)的主要缺點在于高電壓脈沖可引起大量細胞死亡，僅部分細胞膜可以成功修復(fù)，因此相比化學轉(zhuǎn)染方法，電轉(zhuǎn)染需要使用更多數(shù)量的細胞。

實驗步驟：利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞→對含有核酸，緩沖液，細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差，誘導產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測基因表達或沉默情況。

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