原代細胞如何獲取？

原代細胞(primary cell)：是指從機體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體培養(yǎng)的細胞，稱為原代細胞。一般認為，培養(yǎng)的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。

原代細胞的獲取難度大、需要考慮的問題多，原代細胞如何獲取？

原代細胞的獲取，就是從活體上將組織分解成單個細胞再進行培養(yǎng)的過程，且整個過程要求無菌操作。具體要考慮的問題有：組織分解的方式，培養(yǎng)的時間，換液時間，細胞狀態(tài)判斷和凍存。

一、組織分解的方式

將組織分解成單個細胞的方式目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法（針對貼壁細胞）。

1. 酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶。

 膠原酶的選擇：（根據(jù)自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實驗成功的大前提。）

膠原酶的配制：常用的是DMEM進行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。

膠原酶消化時間：根據(jù)組織特性，消化時間會有差異。以小鼠腎細胞為例，加入膠原酶Ⅰ進行消化后，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每隔10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎wan全消失為止（若是組織塊剪得非常細小，時間可以短一些，30min左右即可）。

培養(yǎng)過程：注意原代細胞在培養(yǎng)2天后可能會出現(xiàn)細胞液變黃（橘黃色）的現(xiàn)象，且無漂浮物，這是正常現(xiàn)象哦，不是污染。這是由于細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導致培養(yǎng)液PH發(fā)生了改變，所以變黃。

2. 組織塊法

取材：取組織中間部位，剪成大小均勻的小方塊（1~4mm²），清洗干凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中各組織塊要排列均勻。 

加液：培養(yǎng)液不能浸沒組織塊，避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后換液。

二、培養(yǎng)時間

無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養(yǎng)時間最少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代。

三、換液時間

無論酶消化法還是組織塊法，在培養(yǎng)期間需要隨時關(guān)注細胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

四、細胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細胞在培養(yǎng)幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。這些細胞的狀態(tài)比較好，生長至80%~90%融合就可以傳代啦，傳代一次后的細胞會更干凈漂亮。

五、凍存

傳一代后的細胞（也可以不傳代直接凍存）培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實驗用。

凍存液配制：不同的細胞可能會有不同的凍存液配制方案，各實驗室也有自己的凍存方案，

常見的方案有：

a: 10%DMSO+90%的FBS；

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM；

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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